Использование CRISPR/Cas9 редактирования генома индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, специфичных для пациентов, страдающих врожденным буллезным эпидермолизом, для создания прототипов биомедицинских клеточных продуктов.

ПРОЕКТ

Редактирование генома пациент специфических клеток больных является одним из наиболее перспективных направлений современной регенеративной медицины.

Одной из самых распространенных форм врожденного буллезного эпидермолиза (ВБЭ) является буллезный эпидермолиз простого типа, БЭП. БЭП чаще всего возникает при доминантных мутациях в генах krt14 и krt5, то есть в клетках больных работают гетерозиготные аллели данных генов. Экспрессия гена, содержащего мутацию приводит к нарушению функционирования белка несмотря на наличие не затронутого мутацией второго аллеля данного гена.

В случае гетерозиготной мутации экспрессия содержащего мутацию аллеля приводит к накоплению токсичного белка. В данном проекте мы предлагаем использовать систему CRISPR/Cas9 для получения нокаута гена krt14 на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), полученных из специфических первичных клеток пациента. ИПСК в отличие от первичных клеток обладают большой пролиферативной активностью, это дает возможность получить более представительную библиотеку клонов после трансфекции. ИПСК могут быть репрограммированы в клетки пациентов любого типа. Редактирование ИПСК дает возможность получить изогенные клетки, не содержащие патологической мутации.

ВБЭ - неизлечимое заболевание

В клиниках применяют в основном только симптоматическое лечение. Однако современное развитие технологий регенеративной медицины, клеточные технологии в сочетании с достижениями молекулярной биологии позволяют надеяться на разработку в будущем эффективной генной терапии этих генетических заболеваний.

Редактирование с помощью CRISPR/Cas9 наиболее перспективный подход для генной терапии ВБЭ. Для определения стратегии генотерапевтического подхода необходимо прежде всего определить специфическую мутацию. Для этого применяют технологии высокопроизводительного секвенирования (чаще всего экзомное секвенирование).

Гены, в которых возникают мутации, кодируют как правило структурные белки эпидермиса (это кератины 5 (К5) и 14 (К14), плектин для БЭП), прикрепляющие фибриллы, соединяющие дерму с базальной мембраной (коллаген 7 а-типа), и белки осуществляющие связь эпидермиса с дермой в зоне базальной мембраны (ламинин 332, коллаген 17 и др). Вызывающие ВБЭ как правило аутосомно доминантные или аутосомно рецессивные по типу наследования.

В работе с БЭП мы остановились на специфической мутации krt14 приводящей к тяжелой генерализованной форме Даулинг Меара. В случае экспрессии кератинов в клетке всегда происходит образование гетеродимеров K5 и K14 и дальнейшая полимеризация в кератиновые филаменты. Мутации приводят к нарушению пространственной укладки гетерогибридных молекул и влияют на пострасляционные модификации, вызывая например, гиперфосфорилирование.

В лаборатории есть коллекция пациентспецифических клеток, несущих мутацию krt14, это первичные эпидермальные кератиноциты и дермальные фибробласты и их иммортализованные варианты. Если подвергнуть редактированию мутантный аллель, то оставшийся нетронутым аллель будет обеспечивать клетку фукциональным продуктом. В дальнейшем анализируются те клетки, в которых произошел нокаут именно мутантного аллеля по оценке экспрессии кератина в клетке.

При этом важно проводить сравнение паттернов экспрессии с исходным и с клетками от здоровых доноров. ИПСК являются уникальными клетками с точки зрения их регенеративного потенциала. Редактирование генома ИПСК – наиболее актуальная задача для получения универсальных изогенных пациент специфических клеточных ниш.

Всего было получено 28 полных заявок, все прошли формальную проверку и были направлены на научное рассмотрение.

Призовой фонд составил 1 млн 150 тысяч рублей. Из них Фонд GIAF выделил команде-победителю грант размером 500 000 рублей, а «СайСторЛаб» обеспечил продукцией собственного производства на сумму 250 000 рублей по текущим розничным ценам. Два финалиста конкурса получили по 100 000 рублей от Фонда и реагенты на такую же сумму от «СайСторЛаб». Всем участникам конкурса также будут предоставлены реагенты от «СайСторЛаб» на сумму 10 тысяч рублей для проведения исследований .

Рейтинг заявок по результатам научного рассмотрения представлен ниже. Завершилось рассмотрение заявок на конкурс научно исследовательских работ в области регенеративной медицины.

Всего было получено 28 полных заявок, все прошли формальную проверку и были направлены на научное рассмотрение.

РЕЗУЛЬТАТЫ КОНКУРСА НАУЧНО ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ В ОБЛАСТИ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ

Рейтинг заявок по результатам научного рассмотрения представлен ниже.

В целях защиты персональных данных участников конкурса, а также сохранения конфиденциальности заявок, персональные данные и иная конфиденциальная информация, связанная с проведением конкурса, исключены из открытого доступа.

Мы будем рады предоставить более подробную информацию о конкурсе, а также о процедуре проведения экспертизы проектов всем заинтересованным лицам. В этом случае просим Вас отправить нам соответствующий запрос на электронный адрес: giafound@yandex.ru.